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      質粒DNA大量提取試劑盒

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質粒DNA大量提取試劑盒

產品簡介     
※  本試劑盒采用經典的SDS堿裂解法裂解細胞,離心吸附柱內的硅膠膜和樹脂在高鹽、低pH值狀態下選擇性的結合溶液中的質粒DNA,再通過去蛋白液和漂洗液將雜質和其它細菌成分去除,最后用低鹽、高pH值的洗脫緩沖液將純凈質粒DNA從硅膠膜和樹脂上洗脫。
※  采用進口硅膠膜,吸附量大,產率高,實驗結果重復性好。
※  溶液中添加了作用指示劑,使每一步作用程度一目了然。
  ※  不需要使用有毒的苯酚,氯仿等試劑,也不需要乙醇沉淀。
  ※  快速、方便,從250~500 ml大腸桿菌LB(Luria Bertani)培養液中,可快速提取500~1000ug純凈的高拷貝質粒DNA,提取率達85~90%。
  ※  獲得的質粒產量高,超螺旋比例高、純度好。直接可以用于酶切、轉化、PCR、體外轉錄、測序等各種分子生物學實驗。
操作步驟:
1.試驗前準備及注意事項
 a. 溶液S1 Resuspension Buffer 使用前將RNase A(使用前稍離心)全部加入,均勻混合后4℃保存并標示。
     b. Wash Buffer W1和Wash BufferW2 使用前請按標簽加入無水乙醇并標示。
     c. 使用前檢查溶液S2、溶液S3各試劑是否有沉淀,若有請于37℃或微波爐稍加熱溶解。S2可以在不燙手時使用,S3室溫使用。
     d. 溶液S2 Lysis Buffer及溶液S3用后蓋緊瓶蓋。
2.  收菌  取150~250ml 在LB 培養基中培養過夜的高拷貝數質粒菌液,或500 ml 過夜培養的低拷貝質粒/Cosmid菌液(若使用豐富培養基,菌液體積應減半或更少),≥3,000×g 離心10 min,棄上清。將離心管倒置于紙巾上數分鐘,除盡上清。
3.  重懸菌液  加8ml Buffer S1 懸浮細菌沉淀,懸浮需均勻,不應留有小的
 
菌塊。
* 確認Buffer S1 中已加入RNase A。請充分重懸細菌,若不充分會導致堿裂解不完全。
4.  堿裂解  加8ml Buffer S2,溫和并充分地上下翻轉8-10 次混合均勻使菌體充分裂解,直至形成透亮的溶液。
* Buffer S2 使用后立即蓋緊瓶蓋,以免空氣中的CO2 中和Buffer S2 中的NaOH,降低溶菌效率。
* 避免劇烈搖晃,否則將導致基因組DNA 的污染。
* 此步驟不宜超過5 min。
* Buffer S2 后裂解液會變成藍色,充分混勻以保證形成均一的藍色溶液。
5.  中和  加12ml的Buffer S3,溫和并充分地上下翻轉10-12 次混合均勻,直至形成緊實的凝集塊,室溫放置5 min。
* 加入Buffer S3 后應立即混合,以避免形成局部的凝結塊。
* 避免劇烈搖晃,否則將導致基因組DNA 的污染。
* Buffer S3 后藍色會消失,充分混勻以保證懸浮物中藍色均消失。
6. 過濾 將上清全部轉入過濾柱,3000×g 離心min,如過濾不完全,可以適當延長離心時間。
7. 柱結合  將上述操作的過濾溶液,全部轉入至吸附柱中,10,000×g 離心2 min,如過濾不完全,可以適當延長離心時間棄濾液。
8. 漂洗  將13ml的漂洗緩沖液 加入吸附柱中,10,000×g 離心(4°C)2 min,棄濾液。
9. 再漂洗  將13ml的漂洗緩沖液 加入吸附柱中,10,000×g 離心(4°C)2 min,棄濾液。 空柱10,000×g 離心(4°C)2 min,除去殘留乙醇。
10. 洗脫  將吸附柱置于潔凈的50 ml 離心管中,在吸附柱的膜中央上加1.5 ~3.5ml Elution Buffer,室溫 靜置5 min?!?,000×g 離心5 min 收集質粒DNA。
    注意:Elution Buffer 組成為2.5mM Tris-HCI (pH8.5),不影響測序和酶切反應,。把水或洗脫液加熱于65℃使用時有利于提高洗脫液效率,如果提取的質粒>10kb,請將洗脫液預熱至65℃,并適當延長洗脫時間。
 
質粒DNA濃度和純度檢測
   OD260值為1,相當于50ug/ml的雙鏈DNA。也可以通過DNA Marker通過瓊脂糖凝膠電泳半定量。
   OD260/ OD280比值一般為1.7-1.8,如果洗脫時不使用緩沖液,而使用去離子水,由于受PH值和離子濃度的影響,比值會偏低。
 

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