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      質粒DNA小量提取試劑盒

GalaxyBio Code包裝規格價格說明書購物車
FP01050180元
FP020100320元

質粒DNA小量提取試劑盒

 
質粒DNA小量提取試劑盒
              (離心柱型)
 
 試劑盒內容
4次
Cat:FP015
50次
Cat:FP010
100次
Cat:FP020
RNaseA (10mg/ml)  
30ul
150ul
300ul
溶液S1    Resuspension Buffer
1.5ml
15 ml
30 ml
溶液S2    Lysis Buffer 
1.5ml
15 ml
30 ml
溶液S3    Neutralization Buffer
1.8ml
25 ml
45 ml
漂洗緩沖液 Wash Buffer
1.5ml
15 ml
30 ml
洗脫緩沖液 Elution Buffer
1 ml
15 ml
15 ml
吸附柱     Spin Column
4
50
100
收集管   Collection Tube(2ml)  
4
50
100
說明書     Specification
1
1
1
 
貯存條件:
室溫,有效期一年。溶液S1加入RNase后2-8℃保存
 
產品簡介     
※  本試劑盒采用經典的SDS堿裂解法裂解細胞,離心吸附柱內的硅膠膜在高鹽低pH值狀態下選擇性地結合溶液中的質粒DNA,再通過去蛋白液和漂洗液將雜質和其它細菌成分去除,最后低鹽,高pH值的洗脫緩沖液將純凈質粒DNA從硅膠膜上洗脫。
※  采用進口硅膠膜,吸附量大,產率高,實驗結果可重復性好。
※  溶液中添加了進口作用指示劑,使每一步作用程度一目了然。
  ※  快速、方便,從1~5 ml大腸桿菌LB(Luria Bertani)培養液中,可快速提取15-40 ug純凈的高拷貝質粒DNA,提取率達85~90%。
  ※  獲得的質粒產量高,超螺旋比例高、純度好。 直接可以用于酶切、轉化、PCR、體外轉錄、測序等各種分子生物學實驗。
操作步驟:
1.試驗前準備及注意事項
 a. 溶液S1 Resuspension Buffer 使用前將RNase A全部加入(使用前離心),均勻混合后4℃保存并標示。
 b. 漂洗緩沖液 Wash Buffer 使用前請按標簽加入無水乙醇并標示。
     c. 使用前檢查溶液S2,若有請于37℃或微波爐稍加熱溶解。S2可以在手握不燙手時使用。
     d. 溶液S2 Lysis Buffer及洗脫液用后擰緊瓶蓋。
2. 收菌  取1~5ml過夜培養的菌液,12000rpm離心1分鐘,盡棄上清。
    注意:一般高拷貝質粒用1-3ml菌液,低拷貝質粒用2-10ml菌液。若使用大體積菌液,請相應加大各溶液的體積。
3.  重懸菌液  將250ul溶液S1 Resuspension Buffer (已加RNase A)加入菌液沉淀,Vortex充分懸浮細菌沉淀。
注意:請充分重懸細菌,若不充分會導致堿裂解不完全。
4.  堿裂解  將250ul溶液S2 Lysis Buffer 加入細菌重懸液,溫和地上下翻轉混合6~10次,使菌體充分裂解,直至溶液變得清亮。
    注意:此步請輕柔混合,劇烈混合如Vortex會導致基因組DNA斷裂,從而污染質粒DNA。
          堿裂解不宜超過5分鐘,否則會導致部分質粒DNA不可逆變性。
5.  中和  加入350ul溶液S3 Neutralization Buffer,立即輕柔地上下翻轉混合直至藍色徹底消失。室溫放置5分鐘。室溫12000rpm離心10分鐘。
6.  柱結合  將上述操作的上清液轉移至吸附柱Spin Column中,13000rpm離心1分鐘,棄濾液。
8.  漂洗  將700μl的漂洗緩沖液 Wash Buffer加入吸附柱Spin Column中,12000rpm離心30-60秒,棄濾液。
9.  再漂洗  將700μl的漂洗緩沖液 Wash Buffer加入Spin Column中,12000rpm離心30-60秒,棄濾液。 空柱12000rpm再離心2分鐘,除去殘留乙醇。
10.  洗脫  將Spin Column按置于新的潔凈的1.5ml的離心管上,在吸附柱Spin Column膜的中央處加入30-100μl的PH8.5滅菌水或洗脫緩沖液Elution Buffer,室溫靜置1分鐘,12000rpm離心1分鐘洗脫DNA,可立即用于下游分子生物學實驗或-20℃保存。
    注意:洗脫緩沖液 Elution Buffer組成為10mM Tris-HCI (pH8.5),不影響測序和酶切反應;可以pH8.5滅菌水替代;也可以含有1 mM EDTABuffer TE Buffer洗脫,有助于穩定DNA.洗脫液加熱60使用時有利于提高洗脫液效率,如果提取的質粒>10kb,請將洗脫液預熱至60,并適當延長洗脫時間。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
質粒DNA濃度和純度檢測
   OD260值為1,相當于50ug/ml的雙鏈DNA。也可以通過DNA Marker通過瓊脂糖凝膠電泳半定量。
   OD260/ OD280比值一般為1.7-1.8,如果洗脫時不使用緩沖液,而使用去離子水,由于受PH值和離子濃度的影響,比值會偏低。
 
常見問題分析及解決方案
可能出現的問題
可能原因
建議解決方法
 
 
 
 
 
DNA產量低
 
 
細胞裂解率低
1.   在加入溶液S1后菌泥沒有充分混勻,可漩渦振蕩懸浮液使之充分混勻。
2.   加入溶液S2后,延長孵育時間可獲得清晰的裂解液。
3.   如果溶液S2沒有蓋緊,可能需要重配.可按以下準備:0.2N NaOH,1%SDS.
細菌培養物生長過度或不新鮮
不要于37℃培養超過16小時,分離質粒前長時間存放培養物是不利的.
沒有DNA被洗脫
出來
沒有用乙醇稀釋漂洗液
按前面指導的方法準備漂洗液。
產量中有大分子量的DNA污染
加入溶液S2后過分混和細胞裂解液
加入溶液S2后不要猛烈振蕩或搖勻,可輕輕顛倒離心管幾次使充分混勻
在瓊脂糖凝膠上點樣時,質粒漂出點樣孔
乙醇沒有完全從柱子上去除
在操作過程中的確保完全離心甩干離心吸附柱柱。
 
 
 
 
 
 

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