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      超純質粒大量提取試劑盒-----去內毒素、去蛋白

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超純質粒大量提取試劑盒-----去內毒素、去蛋白

產品簡介     
※  本試劑盒采用經典的SDS堿裂解法裂解細胞,離心吸附柱內的硅膠膜在高鹽低pH值狀態下選擇性地結合溶液中的質粒DNA,再通過去蛋白液和漂洗液將雜質和其它細菌成分去除,最后低鹽,高pH值的洗脫緩沖液將純凈質粒DNA從硅膠膜上洗脫。
  ※  具有高效率的內毒素去除液,有效去內毒素,經檢測,一次分離即符合國家藥典內毒素含量標準。非常適合轉染、轉化及動物免疫及各種分子生物學實驗。
  ※  快速、方便,從150~250 ml大腸桿菌LB(Luria Bertani)培養液中,可快速提取500~1000ug純凈的高拷貝質粒DNA,提取率達85~90%。
  ※  獲得的質粒產量高,超螺旋比例高、純度好。直接可以用于酶切、轉化、PCR、體外轉錄、測序等各種分子生物學實驗。
操作步驟:
1.試驗前準備及注意事項
 a. 溶液S1 Resuspension Buffer 使用前將RNase A(使用前稍離心)全部加入,均勻混合后4℃保存并標示。
     b. Wash Buffer 使用前請按標簽加入無水乙醇并標示。
     c. 使用前檢查溶液S2、溶液S3各試劑是否有沉淀,若有請于37℃或微波爐稍加熱溶解。S2可以在不燙手時使用,S3室溫使用。
     d. 溶液S2、溶液S3及去內毒素溶液S4用后擰緊瓶蓋。
2.  收菌  取150~250ml 在LB 培養基中培養過夜的高拷貝數質粒菌液,或500 ml 過夜培養的低拷貝質粒/Cosmid菌液(若使用豐富培養基,菌液體積應減半或更少),≥3,000×g 離心10 min,棄上清。將離心管倒置于紙巾上數分鐘,除盡上清。
  * 當過夜菌液大于250ml時,可以根據菌體量的多少,嚴格按比例適當加大Buffer S1、S2、S3的使用量,可以得到更好的收率。下表供參考。
  
 培養過夜菌液和各溶液的關系(供參考)

菌液
溶液S1
溶液S2
溶液S3
150~250ml
10ml
10ml
14ml
250~350ml
12ml
12ml
17ml
500ml左右
14ml
14ml
20ml

3.  重懸菌液  加10ml Buffer S1 懸浮細菌沉淀,懸浮需均勻,不應留有小
菌塊。
* 確認Buffer S1 中已加入RNase A。請充分重懸細菌,若不充分會導致堿裂解不完全。
4.  堿裂解  加10ml Buffer S2,溫和并充分地上下翻轉8-10 次混合均勻使菌體充分裂解,直至形成透亮的溶液。
* Buffer S2 使用后立即蓋緊瓶蓋,以免空氣中的CO2 中和Buffer S2 中的NaOH,降低溶菌效率。
* 避免劇烈搖晃,否則將導致基因組DNA 的污染。
* 此步驟不宜超過5 min。
* Buffer S2 后裂解液會變成藍色,充分混勻以保證形成均一的藍色溶液。
5.  中和  加14ml的Buffer S3,溫和并充分地上下翻轉10-12 次混合均勻,直至形成緊實的凝集塊,室溫放置5 min。
* 加入Buffer S3 后應立即混合,以避免形成局部的凝結塊。
* 避免劇烈搖晃,否則將導致基因組DNA 的污染。
* Buffer S3 后藍色會消失,充分混勻以保證懸浮物中藍色均消失。
6. 過濾 將上清全部轉入過濾柱,一般可以靠重力過濾,也可適當3000×g 離心min,。
 
7.  去內毒素
a..將上述操作的上清液體轉移另一離心管中(忌取到沉淀),加10ml 去內毒素S4,振蕩混勻,
b.不時振蕩數次每次30秒。
c. 10,000 rpm,30℃離心5 min。
 d. 溶液分為兩相。上層水相含DNA,下層油狀相含內毒素。
8.  柱結合.將含DNA的上層水相轉移到吸附柱Spin Column中,棄層油狀相。寧肯少提上層水相,也不要不要吸到中間層。一般一次抽提就可以符合標準;也可以根據需要重復抽提2次,即重復步驟a-d兩次
    10,000×g 離心2 min,棄濾液。如過濾不完全,可以適當延長離心時間。
9.  漂洗  將13ml的漂洗緩沖液 加入吸附柱中,10,000×g 離心(4°C)2 min,棄濾液。
10. 再漂洗  將13ml的漂洗緩沖液 加入吸附柱中,10,000×g 離心(4°C)2 min,棄濾液。 空柱10,000×g 離心(4°C)2 min,除去殘留乙醇。
11. 洗脫  將吸附柱置于潔凈的50 ml 離心管中,在吸附柱的膜中央上加1.5 ~3.5ml Elution Buffer,室溫 靜置5 min?!?0,000×g 離心5 min 收集質粒DNA。
    注意:Elution Buffer 組成為2.5mM Tris-HCI (pH8.5),不影響測序和酶切反應,把水或洗脫液加熱于65℃使用時有利于提高洗脫液效率,如果提取的質粒>10kb,請將洗脫液預熱至65℃,并適當延長洗脫時間。
 
質粒DNA濃度和純度檢測
   OD260值為1,相當于50ug/ml的雙鏈DNA。也可以通過DNA Marker通過瓊脂糖凝膠電泳半定量。
   OD260/ OD280比值一般為1.7-1.8,如果洗脫時不使用緩沖液,而使用去離子水,由于受PH值和離子濃度的影響,比值會偏低。
 
 
 
 


 

超純質粒DNA大量提取試劑盒
              (去內毒素、去蛋白)
 

  試劑盒內容
10 TESTS
Cat:FP093
50 TESTS
Cat:FP094
RNaseA (10mg/ml)
300ul×5
300ul×25
溶液S1    Resuspension Buffer
125ml
125 ml×5
溶液S2    Lysis Buffer 
125ml
125 ml×5
溶液S3    Neutralization Buffer
145ml
145 ml×5
105ml
105 ml×5
漂洗緩沖液Wash Buffer
30 ml×2
30 ml×10
洗脫緩沖液 Elution Buffer
15 ml×2
15ml×10
過濾柱    Filter Column
10
50
吸附柱     Spin Column
10
50
收集管  Collection Tube(50ml)  
20
100
說明書     Specification
1
1

 
貯存條件:
室溫,有效期一年。溶液S1加入RNase后2-8℃保存

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