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      T4 DNA Ligase

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T4 DNA Ligase

T4 DNA Ligase
 
 
 
 
 
包裝內容
100次
Cat:FP015
500次
Cat:FP010
T4 DNA Ligase(350 U/μl)
35,000 Units
35,000 UnitsX5
10×T4 DNA Ligase Buffer
1 ml
1ml X5
 
貯存條件:
-20℃保存
 
產品簡介     
該酶催化相鄰DNA鏈的5’-P末端和3’-OH末端以磷酸二酯鍵結合的反應,需ATP作輔酶。本酶不僅可以催化粘性末端之間或平滑末端之間的DNA的連接,也可以催化DNA與RNA之間以及少數RNA之間的連接,修復雙鏈DNA、RNA、DNA/RNA雜交鏈中的單鏈切口
 
起源
Escherichia coli carrying the plasmid that enable highly expression of T4 DNA Ligase gene。
 
酶貯存溶液:
10 mM Tris-HCl (pH 7.5),
0.1 mM EDTA,
50 mM KCl,
1 mM DTT,
50% Glycerol
and 200 μg/ml Nuclease free BSA.
 
活性定義
在20 μl的連接反應體系中,6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反應30分鐘時,有90%以上的DNA片段被連接所需要的酶量定義為1個活性單位(U)。
本酶的1 U相當于ATP-PPi交換反應中0.008 Weiss Unit。    
 
 
 
 
1) 2,000 U的本酶和1 μg的λ-Hind III片段在37℃下反應24小時,DNA的電泳譜帶不發生變化。
2) 2,000 U的本酶和1 μg的Supercoiled pBR322 DNA在37℃下反應24小時,DNA的電泳譜帶不發生變化。
3) 2,000 U的本酶和1 μg的16S,23S rRNA在37℃下反應24小時,RNA
 
1)DNA片段和載體DNA的連接。
2)DNA片段和Linker或Adaptor DNA的連接。
 
使用注意
連接反應因末端堿基順序的不同而反應速度各異,一般有下列傾向:
突出末端:Hind III>Pst I>EcoR I>BamH I>Sal I
平滑末端:Hae III>Alu I>Hinc II>Sma I
EcoR V>Sca I>Pvu II>Nru I
其中連接Hind III末端的速度約為連接Sal I末端速度的10~40倍;
而連接Hae III末端的速度約為連接Sma I末端速度的5~10倍。
 
附帶10×Buffer組成(保存:-20℃)
10×T4 DNA Ligase Buffer
Tris-HCl(pH 7.6) 660 mM
MgCl 66 mM
DTT 100 mM
ATP 1 mM
* Buffer在融解時,如果出現少量沉淀屬正常現象,請于37℃保溫溶解后使用
使用舉例
DNA片段和載體DNA的連接
1. 在微量離心管中制備下列連接反應液。
10×T4 DNA Ligase Buffer          2.5 μl
DNA片段*                       約0.3 pmol
載體DNA**                     約0.03 pmol
T4 DNA Ligase                    1 μl
dH2O                         up to 25 μl
* DNA片段的摩爾數應控制在載體DNA摩爾數的3~10倍。
** 平滑末端的載體與DNA片段進行連接時,應首先將載體進行去
磷酸化處理,以防止其自身環化。
2. 16℃過夜反應。
3. 加入2.5 μl(1/10量)的3 M CH3COONa(pH5.2)。
4. 加入62.5 μl(2.5倍量)的冷無水乙醇,-20℃放置30~60分鐘。
5. 離心回收沉淀,用70%的冷乙醇清洗沉淀,真空干燥。
6. 25~50 μl TE溶解,10~20 μl轉化至100 μl的感受態細胞中。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

   
 

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